細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建技術(shù)服務(wù)

一、研究背景

穩(wěn)轉(zhuǎn)株即穩(wěn)定表達細(xì)胞株，指的是基于某一細(xì)胞系構(gòu)建的持續(xù)過表達或干擾某特定基因的細(xì)胞系。其相對于瞬時轉(zhuǎn)染而言，瞬時轉(zhuǎn)染的外源基因在短時間轉(zhuǎn)錄翻譯得到的蛋白量少，且在細(xì)胞系中過表達或干擾效果的維持時間很短，一般不過1至2周，僅能夠滿足小量蛋白的制備，大量生產(chǎn)成本很高。反觀穩(wěn)轉(zhuǎn)株能夠長期過表達或沉默特定基因，從而能更好地對該基因的一系列機制進行解讀，在生物學(xué)研究中穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建具有舉足輕重的意義。

細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)是通過將外源基因整合至宿主細(xì)胞染色體DNA中，建立長期穩(wěn)定表達目的基因的克隆化細(xì)胞系的核心技術(shù)。慢病毒感染-藥物篩選法是目前廣泛運用的穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建方法，具有高效整合，目標(biāo)細(xì)胞廣泛等特點。該技術(shù)包含載體構(gòu)建、質(zhì)粒合成、慢病毒包裝、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、抗性篩選與單克隆分離幾個關(guān)鍵階段。相比于瞬時轉(zhuǎn)染的短期表達特性，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染建立的細(xì)胞系能持續(xù)表達目標(biāo)蛋白超過6個月，廣泛應(yīng)用于基因功能研究、藥物篩選和大規(guī)模蛋白生產(chǎn)領(lǐng)域。實驗過程中需優(yōu)化抗生素濃度、病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞比例等核心參數(shù)，并通過Western blot或流式細(xì)胞術(shù)驗證基因表達穩(wěn)定性。

二、技術(shù)簡介

逸漠生物采用的包裝系統(tǒng)是二代包裝系統(tǒng)，即三質(zhì)粒系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括1個包裝質(zhì)粒(psPAX2)、1 個包膜質(zhì)粒(pMD2.G)、1個目的基因質(zhì)粒和1株包裝細(xì)胞(293T cell)。

逸漠生物采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染完成后48-72 h進行病毒收獲（即未純化的細(xì)胞上清液），根據(jù)不同的試驗需求，確定采用相應(yīng)的濃縮純化方法得到高濃度的病毒保存液，最后根據(jù)嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)測定慢病毒的各項指標(biāo)。

在一定滴度范圍內(nèi)的慢病毒顆粒對目的細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，將攜帶靶基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞，再依據(jù)載體所含抗性標(biāo)志（如真核表達載體常用的新霉素、潮霉素、嘌呤霉素等抗性篩選標(biāo)志物，實際操作中常用 G418 替代新霉素），通過對應(yīng)藥物篩選出混合陽性克隆。

三、為什么要做細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建？

構(gòu)建細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株（穩(wěn)定表達細(xì)胞株）是細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的重要技術(shù)手段，其核心目的是實現(xiàn)外源基因的持續(xù)、穩(wěn)定表達，滿足基礎(chǔ)研究與應(yīng)用場景的特定需求。

1、基因功能的長期研究

瞬時轉(zhuǎn)染的局限性：瞬時轉(zhuǎn)染（如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染）雖能短期內(nèi)表達外源基因，但通常僅維持 2-7 天，無法模擬基因在細(xì)胞內(nèi)的長期效應(yīng)。例如，研究某腫瘤相關(guān)基因?qū)?xì)胞周期的影響時，需觀察數(shù)周內(nèi)的細(xì)胞增殖變化，穩(wěn)轉(zhuǎn)株可通過持續(xù)表達目的基因提供穩(wěn)定的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

慢性表型分析：在神經(jīng)退行性疾病研究中，需長期觀察淀粉樣蛋白沉積等慢性病理過程，穩(wěn)轉(zhuǎn)株可穩(wěn)定表達致病基因（如突變型 APP 蛋白），為機制研究提供持續(xù)穩(wěn)定的細(xì)胞模型。

2、信號通路與基因網(wǎng)絡(luò)研究

某些信號通路的激活或抑制需持續(xù)刺激（如 Wnt 通路的長期激活），穩(wěn)轉(zhuǎn)株可通過穩(wěn)定表達通路關(guān)鍵蛋白（如 β-catenin），避免反復(fù)轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的損傷，確保通路研究的連續(xù)性。

在基因互作研究中，穩(wěn)轉(zhuǎn)株可同時穩(wěn)定表達多個目的基因（如熒光標(biāo)記蛋白與靶基因），通過熒光追蹤或質(zhì)譜分析，動態(tài)監(jiān)測蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的長期變化。

3、工業(yè)級穩(wěn)定生產(chǎn)

單克隆抗體、重組細(xì)胞因子（如 IL-2）的生產(chǎn)需細(xì)胞系持續(xù)表達目標(biāo)蛋白。例如，CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）穩(wěn)轉(zhuǎn)株經(jīng)篩選后可高密度培養(yǎng)，每升培養(yǎng)基蛋白產(chǎn)量達克級，滿足藥物研發(fā)與商業(yè)化生產(chǎn)需求。

成本與效率優(yōu)化：瞬時轉(zhuǎn)染需反復(fù)操作，且蛋白產(chǎn)量低（通常＜100 mg/L），而穩(wěn)轉(zhuǎn)株可通過馴化適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，實現(xiàn)連續(xù)灌流培養(yǎng)，降低生產(chǎn)成本。

4、穩(wěn)轉(zhuǎn)株 vs. 瞬時轉(zhuǎn)染：核心優(yōu)勢對比

四、操作流程

五、服務(wù)項目

過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株

干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株定制

干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株三保一

六、服務(wù)內(nèi)容

過表達質(zhì)粒制備/干擾序列合成

目的基因的慢病毒制備

慢病毒感染目的細(xì)胞并進行培養(yǎng)

穩(wěn)轉(zhuǎn)混合細(xì)胞株進行抗生素篩選

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進行qPCR檢測和WB檢測

七、服務(wù)流程

客戶提供：細(xì)胞材料，您可以提供自己的細(xì)胞系，也可以從我們的細(xì)胞產(chǎn)品中選擇合適的目的細(xì)胞，但是該細(xì)胞必須能夠保證足夠的可傳代次數(shù)。

我們提供：建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，以及提供建立方法，步驟及結(jié)果。

也可提供基因水平和蛋白水平的驗證：穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株可以根據(jù)您的要求進行基因水平和蛋白水平的驗證， 包括qPCR檢測、WB檢測和流式檢測等。

周期：4-8 周

報價：詢價

八、公司優(yōu)勢

團隊擁有成套完善的技術(shù)體系，進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建

制備的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株純度高，無污染

提供完整并準(zhǔn)確的檢測方案，檢測報告真實可靠

擁有低成本、高效率的制備模式，極大縮短生產(chǎn)周期